ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПАРАМЕТРОВ ЗОНДОВ СКАНИРУЮЩЕГО ЗОНДОВОГО МИКРОСКОПА НА ВИЗУАЛИЗАЦИЮ РЕЛЬЕФА ПОВЕРХНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПАРАМЕТРОВ ЗОНДОВ СКАНИРУЮЩЕГО...
7 МАТЕРИАЛОВЕДЕНИЕ И НАНОТЕХНОЛОГИИ
УДК 53.084.2
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПАРАМЕТРОВ ЗОНДОВ СКАНИРУЮЩЕГО ЗОНДОВОГО МИКРОСКОПА НА ВИЗУАЛИЗАЦИЮ
РЕЛЬЕФА ПОВЕРХНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
А.В. Стовпяга, И.Н. Лобова
Проведен качественный анализ изображений рельефа поверхности биологических объектов (эритроцитов), получаемых с помощью сканирующего зондового микроскопа (СЗМ) при использовании зондов различного типа с различными геометрическими параметрами. Прослежено влияние геометрических параметров зондов на СЗМ-изображения образцов и определен ориентировочный критерий отбора зондов для исследования эритроцитов. Ключевые слова: сканирующая зондовая микроскопия, растровая электронная микроскопия, нанопипетка, нанозонды, анализ изображений.
Введение Одним из основных инструментов нанотехнологий является сканирующая зондовая микроскопия [1, 2], объединяющая широкий спектр современных средств исследования и модификации поверхностей различных материалов, в том числе и биологического происхождения, например, эритроцитов. В последнем случае существует потребность применения универсальных зондов, в частности, нанопипеток [3], дающих возможность одновременно исследовать рельеф поверхности биообъектов, картировать их жесткость и мембранную проводимость в режиме ионных токов. В данной работе производился сравнительный анализ СЗМ-изображений, полученных при использовании нанопипетки, а также вольфрамового и кремниевого зондов.
Объект, оборудование и методика исследования Объектом исследования являлись эритроциты, нанесенные на стеклянную подложку. В качестве эталона для калибровки СЗМ и оценки соответствия полученных изображений поверхности реального объекта применялась калибровочная мера в виде периодической двумерной решетки (TGT-решетка фирмы NT-MDT) (рис. 1). Размер решетки – 5×5 мм, наибольшее расстояние между двумя соседними конусными пиками 3±0,05 мкм, высота пика 0,3–0,5 мкм, радиус закругления острия пика около 10 нм.
Рис. 1. Схема TGT-решетки
В процессе исследований использовались растровый электронный микроскоп (РЭМ) «Inspect», СЗМ «NTEGRA Aura» и СЗМ «NANOEDUCATOR».
В случае СЗМ, как известно, сканирование осуществляется острым твердотельным зондом (радиус закругления зонда 10–100 нм), а РЭМ позволяет визуализировать поверхность образца за счет ее сканирования электронным зондом диаметром 5–10 нм.
Методика проведения исследования включала следующие этапы: калибровка РЭМ с помощью калибровочной меры (TGT-решетки); определение геометрических параметров зондов для СЗМ с помощью РЭМ; калибровка СЗМ с помощью TGT-решетки с использованием зонда в виде кремниевого кантилевера
на СЗМ «NTEGRA Aura» и зондов в виде вольфрамового острия и стеклянной нанопипетки, закрепленных на пьезорезонансном датчике СЗМ «NANOEDUCATOR» [4, 5]; получение и анализ изображений поверхности эритроцитов с использованием кремниевого зонда СЗМ «NTEGRA Aura», вольфрамового зонда и нанопипетки на СЗМ «NANOEDUCATOR».
94 Научно-технический вестник Санкт-Петербургского государственного университета
информационных технологий, механики и оптики, 2010, № 6 (70)
А.В. Стовпяга, И.Н. Лобова
Калибровка РЭМ На рис. 2 представлено изображение пиков TGT-решетки, полученное с помощью РЭМ «Inspect». Расстояния между соседними пиками составляет 3 мкм, что соответствует паспортным данным.
Рис. 2. Электронно-микроскопическое изображение TGT-решетки (РЭМ «Inspect»)
Определение геометрических параметров зондов
С помощью РЭМ определены геометрические параметры нанопипетки и вольфрамового острия: радиус острия нанопипетки около 286 нм с углом при вершине около 12° (рис. 3); радиус острия вольфрамового зонда около 57 нм с углом при вершине около 11° (рис. 4).
Параметры кремниевого зонда взяты из паспортных данных: радиус острия – 10 нм, угол при вершине – не более 10°.
аб
Рис. 3. Электронные микрофотографии нанопипетки (РЭМ «Inspect»): а) радиус вершины около 286 нм; б) угол при вершине около 12°
Рис. 4. Электронные микрофотографии вольфрамого зонда (РЭМ «Inspect»). Радиус закругления при вершине около 57 нм, угол при вершине около 11°
Чем меньше радиус и угол при вершине острия, тем, как известно, лучше пространственное разрешение СЗМ и тем больше соответствие получаемых СЗМ-изображений реальному рельефу поверхности сканируемых объектов. Как следует из приведенных данных, наилучшим разрешением обладает кремниевый зонд. Ниже будет проведено сравнение результатов исследования поверхности эритроцитов, полученных с использованием различных зондов.
Научно-технический вестник Санкт-Петербургского государственного университета информационных технологий, механики и оптики, 2010, № 6 (70)
95
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПАРАМЕТРОВ ЗОНДОВ СКАНИРУЮЩЕГО...
Калибровка СЗМ На рис. 5 представлены результаты калибровочного сканирования остроконечных пиков TGTрешетки с помощью кремниевого зонда. Расстояния между соседними пиками после проведения калибровки стали близки к паспортным данным TGT-решетки. В процессе процедуры калибровки определялась чувствительность микросканера СЗМ. Адекватность процесса калибровки подтверждается соответствием периода на СЗМ-изображении и паспортными данными для периода TGT-решетки.
Y, нм
X, нм Рис. 5. СЗМ-изображения TGT-решетки, полученные кремниевым зондом На рис. 6 представлены 3D-изображения остроконечных пиков TGT-решетки, полученные с помощью кремниевого зонда (СЗМ «NTEGRA Aura»), вольфрамового зонда и зонда в виде нанопипетки (СЗМ «NANOEDUCATOR»). Поскольку радиус закругления вершин остроконечных пиков TGT-решетки меньше, чем характерный размер вершин вольфрамового острия и нанопипетки, то на СЗМизображениях, представленных на рис. 6, б, в, фактически наблюдается периодически повторяющийся рельеф вершин используемых зондов. Из рис. 6, а, б, в, видно, что наименьший радиус, как и ожидалось, имеет кремниевый зонд, а наибольший характерный размер при вершине имеет стеклянная нанопипетка. Кроме того, следует отметить, что в случае со стеклянной нанопипеткой на СЗМ-изображении (рис. 6, в) можно обнаружить раздвоение пиков, связанное с наличием внутреннего отверстия в нанопипетке. В этом случае нанопипетка в процессе сканирования взаимодействует с вершиной пика TGT-решетки одним краем отверстия, затем проваливается в отверстие и после этого взаимодействует с вершиной пика другим краем.
абв Рис. 6. 3D-изображения TGT-решетки: а) кремниевый зонд (СЗМ «NTEGRA Aura»);
б) вольфрамовый зонд; в) нанопипетка (СЗМ «NANOEDUCATOR»)
Полученные 3D-изображения вершин нанозондов подчеркивают решающее влияние геометрических параметров зондов на качество СЗМ-изображений. В случае использования кремниевого зонда все пики имеют остроконечные вершины. Сканирование вольфрамовым зондом (менее острым, чем кремниевый) сглаживает изображение пиков TGT-решетки, так как радиус вольфрамового зонда больше, чем радиус пиков решетки, а использование нанопипетки приводит к раздвоению острых пиков на СЗМизображении.
Получение и анализ изображений поверхности эритроцитов Как и ожидалось, лучшие изображения поверхности эритроцитов получены на СЗМ «NTEGRA Aura» с помощью кремниевого зонда с оптической схемой регистрации отклонения кантилевера (рис. 7, а). В случае вольфрамового зонда с пьезорезонансным датчиком силового взаимодействия (СЗМ «NANOEDUCATOR») наблюдается менее точная визуализация рельефа (рис. 7, б), которая, однако, позволяет производить картирование локальной жесткости поверхности эритроцита. При использовании этого же пьезорезонансного датчика с зондом в виде стеклянной нанопипетки (рис. 7, в) наблюда-
96 Научно-технический вестник Санкт-Петербургского государственного университета
информационных технологий, механики и оптики, 2010, № 6 (70)
А.В. Стовпяга, И.Н. Лобова
лись наибольшие искажения при визуализации поверхности эритроцитов, что вызвано как большим радиусом острия нанопипетки, так и наличием в ней отверстия. Вместе с тем зонд-нанопипетка дает правильную информацию о размерах и средней топографии клетки.
абв Рис. 7. СЗМ-изображения эритроцитов: а) кремниевый зонд (СЗМ «NTEGRA Aura»);
б) вольфрамовый зонд, в) нанопипетка (СЗМ «NANOEDUCATOR»)
Заключение
В результате проведенных исследований можно сделать следующие выводы:
наиболее подробные и точные сведения о размерах, форме и рельефе поверхности эритроцитов получаются при использовании кремниевых зондов с оптической схемой регистрации отклонения кантилевера;
вольфрамовый зонд с пьезорезонансным датчиком и большим радиусом вершины, чем у кремниевого, позволяет очертить внешние границы и рельеф эритроцитов менее точно и с меньшим количеством разрешаемых деталей рельефа;
зонд с пьезорезонансным датчиком силового взаимодействия, несмотря на сложную форму в виде цилиндра с внутренним отверстием, позволяет получить информацию о размерах и усредненной топографии поверхности эритроцитов.
зонд в виде стеклянной нанопипетки представляет особый интерес в связи с возможностью проведения СЗМ-исследований в жидкости с одновременным измерением как топографии поверхности, так и карты распределения ионных токов. Качественный анализ полученных в данной работе результатов позволяет сделать вывод о том, что
для визуализации рельефа эритроцитов с помощью СЗМ с зондом в виде нанопипетки целесообразно применять нанопипетки с параметрами не хуже, чем у использованного в работе вольфрамового зонда. Исследования эритроцитов с применением в СЗМ универсального зонда-нанопипетки с достаточным пространственным разрешением возможны при радиусе вершины зонда не более 60 нм. Данную величину можно рассматривать как ориентировочный критерий отбора нанопипеток по геометрическим параметрам.
Работа выполнена в рамках реализации и при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 годы (НК-556П/89, ГК П557).
Литература
1. Binning G., Quate C.F. Atomic Force Microscope // Physical Review Letters. – 1986. – V. 56. – № 9. – Р. 930–933.
2. Миронов В.Л. Основы сканирующей зондовой микроскопии. – M.: Техносфера, 2005. – 144 с. 3. Shevchuk A., Frolenkov G., Sanchez D., James P.S. Imaging Protein in Membranes of Living Cells by
High–Resolution Scanning Ion Conductance Microscopy // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. – 2006. – V. 45(14). – P. 2212–2216. 4. Быков В.А., Васильев В.Н., Голубок А.О. Учебно-исследовательская мини-лаборатория по нанотехнологии на базе сканирующего зондового микроскопа «НАНОЭДЬЮКАТОР» // Российские нанотехнологии. – 2009. – Т. 4. – № 5–6. – С. 45–47. 5. Голубок А.О., Васильев А.А., Керпелева С.Ю., Котов В.В., Сапожников И.Д. Датчик локального силового и туннельного взаимодействия в сканирующем зондовом микроскопе // Научное приборостроение. – 2005. – Т. 15. – № 1. – С. 62–69.
Лобова Инна Николаевна
– Санкт-Петербургский государственный университет информаци-
онных технологий, механики и оптики, студентка,
inna_kurchatov@mail.ru
Стовпяга Александр Владимирович – Санкт-Петербургский государственный университет информаци-
онных технологий, механики и оптики, аспирант,
sanja100v@mail.ru
Научно-технический вестник Санкт-Петербургского государственного университета информационных технологий, механики и оптики, 2010, № 6 (70)
97
7 МАТЕРИАЛОВЕДЕНИЕ И НАНОТЕХНОЛОГИИ
УДК 53.084.2
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПАРАМЕТРОВ ЗОНДОВ СКАНИРУЮЩЕГО ЗОНДОВОГО МИКРОСКОПА НА ВИЗУАЛИЗАЦИЮ
РЕЛЬЕФА ПОВЕРХНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
А.В. Стовпяга, И.Н. Лобова
Проведен качественный анализ изображений рельефа поверхности биологических объектов (эритроцитов), получаемых с помощью сканирующего зондового микроскопа (СЗМ) при использовании зондов различного типа с различными геометрическими параметрами. Прослежено влияние геометрических параметров зондов на СЗМ-изображения образцов и определен ориентировочный критерий отбора зондов для исследования эритроцитов. Ключевые слова: сканирующая зондовая микроскопия, растровая электронная микроскопия, нанопипетка, нанозонды, анализ изображений.
Введение Одним из основных инструментов нанотехнологий является сканирующая зондовая микроскопия [1, 2], объединяющая широкий спектр современных средств исследования и модификации поверхностей различных материалов, в том числе и биологического происхождения, например, эритроцитов. В последнем случае существует потребность применения универсальных зондов, в частности, нанопипеток [3], дающих возможность одновременно исследовать рельеф поверхности биообъектов, картировать их жесткость и мембранную проводимость в режиме ионных токов. В данной работе производился сравнительный анализ СЗМ-изображений, полученных при использовании нанопипетки, а также вольфрамового и кремниевого зондов.
Объект, оборудование и методика исследования Объектом исследования являлись эритроциты, нанесенные на стеклянную подложку. В качестве эталона для калибровки СЗМ и оценки соответствия полученных изображений поверхности реального объекта применялась калибровочная мера в виде периодической двумерной решетки (TGT-решетка фирмы NT-MDT) (рис. 1). Размер решетки – 5×5 мм, наибольшее расстояние между двумя соседними конусными пиками 3±0,05 мкм, высота пика 0,3–0,5 мкм, радиус закругления острия пика около 10 нм.
Рис. 1. Схема TGT-решетки
В процессе исследований использовались растровый электронный микроскоп (РЭМ) «Inspect», СЗМ «NTEGRA Aura» и СЗМ «NANOEDUCATOR».
В случае СЗМ, как известно, сканирование осуществляется острым твердотельным зондом (радиус закругления зонда 10–100 нм), а РЭМ позволяет визуализировать поверхность образца за счет ее сканирования электронным зондом диаметром 5–10 нм.
Методика проведения исследования включала следующие этапы: калибровка РЭМ с помощью калибровочной меры (TGT-решетки); определение геометрических параметров зондов для СЗМ с помощью РЭМ; калибровка СЗМ с помощью TGT-решетки с использованием зонда в виде кремниевого кантилевера
на СЗМ «NTEGRA Aura» и зондов в виде вольфрамового острия и стеклянной нанопипетки, закрепленных на пьезорезонансном датчике СЗМ «NANOEDUCATOR» [4, 5]; получение и анализ изображений поверхности эритроцитов с использованием кремниевого зонда СЗМ «NTEGRA Aura», вольфрамового зонда и нанопипетки на СЗМ «NANOEDUCATOR».
94 Научно-технический вестник Санкт-Петербургского государственного университета
информационных технологий, механики и оптики, 2010, № 6 (70)
А.В. Стовпяга, И.Н. Лобова
Калибровка РЭМ На рис. 2 представлено изображение пиков TGT-решетки, полученное с помощью РЭМ «Inspect». Расстояния между соседними пиками составляет 3 мкм, что соответствует паспортным данным.
Рис. 2. Электронно-микроскопическое изображение TGT-решетки (РЭМ «Inspect»)
Определение геометрических параметров зондов
С помощью РЭМ определены геометрические параметры нанопипетки и вольфрамового острия: радиус острия нанопипетки около 286 нм с углом при вершине около 12° (рис. 3); радиус острия вольфрамового зонда около 57 нм с углом при вершине около 11° (рис. 4).
Параметры кремниевого зонда взяты из паспортных данных: радиус острия – 10 нм, угол при вершине – не более 10°.
аб
Рис. 3. Электронные микрофотографии нанопипетки (РЭМ «Inspect»): а) радиус вершины около 286 нм; б) угол при вершине около 12°
Рис. 4. Электронные микрофотографии вольфрамого зонда (РЭМ «Inspect»). Радиус закругления при вершине около 57 нм, угол при вершине около 11°
Чем меньше радиус и угол при вершине острия, тем, как известно, лучше пространственное разрешение СЗМ и тем больше соответствие получаемых СЗМ-изображений реальному рельефу поверхности сканируемых объектов. Как следует из приведенных данных, наилучшим разрешением обладает кремниевый зонд. Ниже будет проведено сравнение результатов исследования поверхности эритроцитов, полученных с использованием различных зондов.
Научно-технический вестник Санкт-Петербургского государственного университета информационных технологий, механики и оптики, 2010, № 6 (70)
95
ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПАРАМЕТРОВ ЗОНДОВ СКАНИРУЮЩЕГО...
Калибровка СЗМ На рис. 5 представлены результаты калибровочного сканирования остроконечных пиков TGTрешетки с помощью кремниевого зонда. Расстояния между соседними пиками после проведения калибровки стали близки к паспортным данным TGT-решетки. В процессе процедуры калибровки определялась чувствительность микросканера СЗМ. Адекватность процесса калибровки подтверждается соответствием периода на СЗМ-изображении и паспортными данными для периода TGT-решетки.
Y, нм
X, нм Рис. 5. СЗМ-изображения TGT-решетки, полученные кремниевым зондом На рис. 6 представлены 3D-изображения остроконечных пиков TGT-решетки, полученные с помощью кремниевого зонда (СЗМ «NTEGRA Aura»), вольфрамового зонда и зонда в виде нанопипетки (СЗМ «NANOEDUCATOR»). Поскольку радиус закругления вершин остроконечных пиков TGT-решетки меньше, чем характерный размер вершин вольфрамового острия и нанопипетки, то на СЗМизображениях, представленных на рис. 6, б, в, фактически наблюдается периодически повторяющийся рельеф вершин используемых зондов. Из рис. 6, а, б, в, видно, что наименьший радиус, как и ожидалось, имеет кремниевый зонд, а наибольший характерный размер при вершине имеет стеклянная нанопипетка. Кроме того, следует отметить, что в случае со стеклянной нанопипеткой на СЗМ-изображении (рис. 6, в) можно обнаружить раздвоение пиков, связанное с наличием внутреннего отверстия в нанопипетке. В этом случае нанопипетка в процессе сканирования взаимодействует с вершиной пика TGT-решетки одним краем отверстия, затем проваливается в отверстие и после этого взаимодействует с вершиной пика другим краем.
абв Рис. 6. 3D-изображения TGT-решетки: а) кремниевый зонд (СЗМ «NTEGRA Aura»);
б) вольфрамовый зонд; в) нанопипетка (СЗМ «NANOEDUCATOR»)
Полученные 3D-изображения вершин нанозондов подчеркивают решающее влияние геометрических параметров зондов на качество СЗМ-изображений. В случае использования кремниевого зонда все пики имеют остроконечные вершины. Сканирование вольфрамовым зондом (менее острым, чем кремниевый) сглаживает изображение пиков TGT-решетки, так как радиус вольфрамового зонда больше, чем радиус пиков решетки, а использование нанопипетки приводит к раздвоению острых пиков на СЗМизображении.
Получение и анализ изображений поверхности эритроцитов Как и ожидалось, лучшие изображения поверхности эритроцитов получены на СЗМ «NTEGRA Aura» с помощью кремниевого зонда с оптической схемой регистрации отклонения кантилевера (рис. 7, а). В случае вольфрамового зонда с пьезорезонансным датчиком силового взаимодействия (СЗМ «NANOEDUCATOR») наблюдается менее точная визуализация рельефа (рис. 7, б), которая, однако, позволяет производить картирование локальной жесткости поверхности эритроцита. При использовании этого же пьезорезонансного датчика с зондом в виде стеклянной нанопипетки (рис. 7, в) наблюда-
96 Научно-технический вестник Санкт-Петербургского государственного университета
информационных технологий, механики и оптики, 2010, № 6 (70)
А.В. Стовпяга, И.Н. Лобова
лись наибольшие искажения при визуализации поверхности эритроцитов, что вызвано как большим радиусом острия нанопипетки, так и наличием в ней отверстия. Вместе с тем зонд-нанопипетка дает правильную информацию о размерах и средней топографии клетки.
абв Рис. 7. СЗМ-изображения эритроцитов: а) кремниевый зонд (СЗМ «NTEGRA Aura»);
б) вольфрамовый зонд, в) нанопипетка (СЗМ «NANOEDUCATOR»)
Заключение
В результате проведенных исследований можно сделать следующие выводы:
наиболее подробные и точные сведения о размерах, форме и рельефе поверхности эритроцитов получаются при использовании кремниевых зондов с оптической схемой регистрации отклонения кантилевера;
вольфрамовый зонд с пьезорезонансным датчиком и большим радиусом вершины, чем у кремниевого, позволяет очертить внешние границы и рельеф эритроцитов менее точно и с меньшим количеством разрешаемых деталей рельефа;
зонд с пьезорезонансным датчиком силового взаимодействия, несмотря на сложную форму в виде цилиндра с внутренним отверстием, позволяет получить информацию о размерах и усредненной топографии поверхности эритроцитов.
зонд в виде стеклянной нанопипетки представляет особый интерес в связи с возможностью проведения СЗМ-исследований в жидкости с одновременным измерением как топографии поверхности, так и карты распределения ионных токов. Качественный анализ полученных в данной работе результатов позволяет сделать вывод о том, что
для визуализации рельефа эритроцитов с помощью СЗМ с зондом в виде нанопипетки целесообразно применять нанопипетки с параметрами не хуже, чем у использованного в работе вольфрамового зонда. Исследования эритроцитов с применением в СЗМ универсального зонда-нанопипетки с достаточным пространственным разрешением возможны при радиусе вершины зонда не более 60 нм. Данную величину можно рассматривать как ориентировочный критерий отбора нанопипеток по геометрическим параметрам.
Работа выполнена в рамках реализации и при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 годы (НК-556П/89, ГК П557).
Литература
1. Binning G., Quate C.F. Atomic Force Microscope // Physical Review Letters. – 1986. – V. 56. – № 9. – Р. 930–933.
2. Миронов В.Л. Основы сканирующей зондовой микроскопии. – M.: Техносфера, 2005. – 144 с. 3. Shevchuk A., Frolenkov G., Sanchez D., James P.S. Imaging Protein in Membranes of Living Cells by
High–Resolution Scanning Ion Conductance Microscopy // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. – 2006. – V. 45(14). – P. 2212–2216. 4. Быков В.А., Васильев В.Н., Голубок А.О. Учебно-исследовательская мини-лаборатория по нанотехнологии на базе сканирующего зондового микроскопа «НАНОЭДЬЮКАТОР» // Российские нанотехнологии. – 2009. – Т. 4. – № 5–6. – С. 45–47. 5. Голубок А.О., Васильев А.А., Керпелева С.Ю., Котов В.В., Сапожников И.Д. Датчик локального силового и туннельного взаимодействия в сканирующем зондовом микроскопе // Научное приборостроение. – 2005. – Т. 15. – № 1. – С. 62–69.
Лобова Инна Николаевна
– Санкт-Петербургский государственный университет информаци-
онных технологий, механики и оптики, студентка,
inna_kurchatov@mail.ru
Стовпяга Александр Владимирович – Санкт-Петербургский государственный университет информаци-
онных технологий, механики и оптики, аспирант,
sanja100v@mail.ru
Научно-технический вестник Санкт-Петербургского государственного университета информационных технологий, механики и оптики, 2010, № 6 (70)
97