Например, Бобцов

Ярко люминесцирующие метки на основе наночастиц из комплексов ионов металлов с кумарином 30

ФИЗИЧЕСКАЯ ОПТИКА
УДК 535.37
ЯРКО ЛЮМИНЕСЦИРУЮЩИЕ МЕТКИ НА ОСНОВЕ НАНОЧАСТИЦ ИЗ КОМПЛЕКСОВ ИОНОВ МЕТАЛЛОВ С КУМАРИНОМ 30
© 2013 г. С. С. Дударь, канд. физ.-мат. наук; Л. Ю. Миронов, магистр
СПбНИУ ИТМО, Санкт-Петербург
Е-mail: electr9@yandex.ru, lu.mironov@mail.ru
Исследована сенсибилизованная флуоресценция кумарина 30 в наночастицах, самоорганизующихся из комплексов фенилбензоилтрифторацетона и 1,10-фенантролина с ионами лантанидов, иттрия, алюминия и скандия в водно-спиртовых растворах. Показано, что при формировании наночастиц из комплексов ионов лантанидов и иттрия молекулы кумарина 30 полностью внедряются из раствора в наночастицы. Обнаружено отсутствие концентрационного тушения кофлуоресценции кумарина 30 в наночастицах во всей области исследованных концентраций красителя. Приведены факты, доказывающие внедрение кумарина 30 в комплексы лантанидов и иттрия в качестве синергического бидентантного лиганда. Продемонстрирована возможность создания ярко люминесцирующих меток, поглощающих не только в области 360–370 нм, но и в области 440–450 нм и обладающих узким спектром флуоресценции с максимумом на  = 520 нм.
Ключевые слова: люминесцентные метки, флуоресценция наночастиц, кофлуоресценция, перенос энергии, миграция энергии, наночастицы, красители, кумарин 30, дикетонатные комплексы ионов металлов, лантаниды.
Коды OCIS: 260.2160, 260.5130, 260.3800, 300.6280.
Поступила в редакцию 05.07.2012.

Введение
Интерес к исследованию люминесцирующих наночастиц (НЧ) вызван их применением в качестве люминесцентных меток в области иммунофлуоресцентного анализа и в исследовании строения биологических объектов. Актуальной является задача детектирования малых концентраций люминесцентных меток и получение набора ярко люминесцирующих маркеров в различных областях спектра. Решение данной задачи может быть достигнуто благодаря использованию явления внедрения катионных, анионных или нейтральных молекул органических красителей в НЧ из органических комплексов ионов трехвалентных металлов и -дикетонов в процессе самоорганизации этих НЧ в водных растворах, содержащих эти ионы и органические лиганды. Внедрение красителей в НЧ позволяет увеличить интенсивность их флуоресценции с помощью сенсибилизации красителей при возбуждении

в полосу поглощения комплексов НЧ в результате безызлучательного переноса энергии на молекулы красителя от всей совокупности тысяч возбуждаемых комплексов, составляющих наночастицу. Аккумулирование на молекуле красителя энергии электронного возбуждения от большого ансамбля комплексов внутри НЧ приводит к появлению сенсибилизованной флуоресценции (кофлуоресценции) красителя (pис. 1) с интенсивностью, превышающей от одного до двух порядков величины интенсивность флуоресценции свободного красителя в воде при его возбуждении в максимум собственной полосы поглощения. Данное явление, впервые обнаруженное и исследованное нами в 2008–2010 гг. [1–3], было использовано в представляемой работе для создания ярко люминесцирующих меток на основе НЧ из комплексов металлов с кумарином 30, которые могут повышать чувствительность иммунофлуоресцентного анализа, применяющего красители в качестве люминесцентных меток. Эти же

“Оптический журнал”, 80, 3, 2013

3

hexc 365 нм

500–670 нм hcofl

–M3+ (-дикетон)3phen

–dye molecule

Рис. 1. Схема супрамолекулярной светособирающей наноструктуры, самоорганизующейся в водных растворах из комплексов ионов трехвалентных металлов (М3+) с антенными лигандами: -дикетоном и 1,10-фенантролином (phen), с внедренной молекулой красителя.

НЧ, а также НЧ из полимеров, допированные молекулами красителей, могут быть использованы как ярко флуоресцирующие метки в биологии [4].
В водных растворах, содержащих ионы одного из металлов (III), таких как Al, Sc, In, Y, Lu, Gd, Eu, Tb, в концентрации порядка 10 мкМ и -дикетоны в концентрации порядка 30 мкМ, образуются НЧ из комплексов этих ионов, имеющие диаметр 10–40 нм [5–7] и состоящие из 1000–100 000 комплексов. Молекулы красителей могут внедряться во внутренний объем НЧ, который близок по свойствам к твердому телу, или адсорбироваться на поверхности НЧ, граничащей с раствором. Изначально неизвестно, какая доля растворенных молекул красителей внедрится внутрь НЧ и какая окажется на поверхности этих НЧ, как будет изменяться квантовый выход флуоресценции qfl красителей при их внедрении в НЧ и росте их концентраций, как влияет присутствие спирта в водном растворе на все эти параметры. Для получения высокой яркости сенсибилизованной флуоресценции красителей в этих НЧ необходимо, чтобы энергия возбуждения большинства комплексов была передана молекулам красителя и чтобы qfl самого красителя был высоким. Яркость красителей в исследованных ранее НЧ, допированных молекулами нильского синего (NB), нильского красного (NR) и родамина 6G (R6G), существенно возрастала по сравнению с водными растворами этих красителей. Но появление концентрационного тушения этих кра-

сителей в НЧ в условиях неполного переноса энергии от комплексов не позволяло достичь предельной возможной яркости их свечения. Рост сенсибилизованной флуоресценции красителей в НЧ по мере увеличения концентрации красителей в водном растворе прекращался уже при 50–100 нМ красителя. Структура молекул красителя кумарина 30 (С30) позволяет предполагать, что при больших концентрациях С30 в растворе его молекулы могут участвовать в формировании комплексов Ln(III) и Y(III) как бидентантные синергические агенты. Такое встраивание С30 в комплексы и НЧ из них должно вести к отличию закономерностей их кофлуоресценции в НЧ от ранее наблюдавшихся закономерностей для красителей, внедрявшихся в структуры НЧ как примесь.
В представленной работе впервые была исследована кофлуоресценция красителя С30 наряду с тушением флуоресценции передающих ему свою энергию комплексов, на порядки различающихся величинами fl, в НЧ из комплексов Al, Sc, Y, La, Gd, Lu c п-фенилбензоилтрифторацетоном (PhBTA) и 1,10-фенантролином (phen). -дикетон PhBTA впервые был использован и изучен в этой работе в качестве органического лиганда комплекса для создания НЧ. Изучение процесса переноса энергии в этих НЧ позволило определить условия наилучшей сенсибилизации красителя С30 и показало возможность создания ярко люминесцирующих меток на основе НЧ из комплексов, допированных молекулами красителей.
Методика эксперимента
В нашей работе при синтезе НЧ из комплексов металлов M(III) использовался метод самосборки комплексов в НЧ. Самосборка комплексов в НЧ осуществлялась в процессе их формирования в водном растворе, содержащем органические лиганды, ионы металлов и примеси красителей, захватываемых в эти НЧ [1]. Из-за низкой растворимости лиганда PhBTA в воде формирование НЧ из комплексов ионов металлов с этим дикетоном осуществлялось в водно-спиртовом растворе после предварительного растворения этого дикетона в изопропанольном растворе. Для создания в водно-спиртовом растворе НЧ, имеющих размер 10–40 нм, используются концентрации дикетонов в области 30–100 мкМ. Размер образующихся НЧ убывает по мере роста концен-

4 “Оптический журнал”, 80, 3, 2013

трации спирта в растворе. Поэтому прежде чем формировать НЧ из комплексов M(III) были исследованы растворимость PhBTA в водно-изопропанольных растворах и способность его комплексов с ионами металлов и phen формировать НЧ, сенсибилизующие захватываемые ими из раствора молекулы красителей. При концентрации PhBTA 30 мкМ его растворы оставались стабильными, начиная с концентрации 10 об.% изопропанола в воде. С ростом концентрации изопропанола в растворах 10 мкМ M(III) + 30 мкМ PhBTA + 10 мкМ phen с красителем интенсивность его кофлуоресценции (Iсоfl) уменьшалась. Поскольку величина Iсоfl красителей была наибольшей в 10%-ном растворе изопропанола, все дальнейшие измерения флуоресценции НЧ из комплексов этого дикетона проводились в растворах такого состава. Наличие кофлуоресценции и рост ее интенсивности во времени свидетельствуют о формировании НЧ и росте размера НЧ в растворе. Для приготовления растворов НЧ использовались хлориды Al(III), Y(III), La(III), Lu(III) и Gd(III), а также ацетат Sc(III) марки х.ч. Дикетон и phen фирмы Chemapol использовались без дополнительной очистки. В качестве растворителей использовалась дистиллированная вода и изопропанол марки осч. В НЧ из комплексов внедрялся нейтральный краситель C30 фирмы НИОПИК. Все компоненты раствора вводились путем интенсивного перемешивания раствора лигандов в изопропаноле и водно-cпиртового раствора солей металлов и красителей. Методика приготовления растворов влияла на количество молекул красителя, внедренных в НЧ, и на однородность состава НЧ. Поэтому способ приготовления раствора и время между моментом приготовления раствора и временем измерения его флуоресценции было строго регламентировано.
При исследовании кофлуоресценции С30 в НЧ из комплексов PhBTA с ионами легких металлов Al(III) и Sc(III) длинноволновая часть спектра интенсивной флуоресценции комплексов перекрывалась со спектром C30, что мешало измерению величин Iсоfl С30 в области концентраций С30, меньших концентрации НЧ в растворе. Величина qfl флуоресценции C30 в исследуемом растворе (90 об% воды +10 об% изопропанола) была определена путем сравнения с его флуоресценцией в 50%-ном растворе этанола, в котором он равен 0,35 [8]. Величина qfl C30 в 10%-ном

растворе изопропанола в воде оказалась рав-
ной 0,09. Квантовый выход флуоресценции
НЧ, формирующихся из комплексов Al и Sc
в водно-спиртовом 10%-ном растворе, содер-
жащем 10 мкМ Al(III) или Sc(III) + 30 мкМ
PhBTA + 10 мкМ phen, был определен пу-
тем сравнения их величин qfl с величиной 9,10-пропилантрацена в этаноле qfl = 0,76 [9]. Величина qfl комплексов Sc в изучаемых растворах оказалась равной 0,015.
Соизмеримость величин qfl и близость положения максимумов спектров флуоресценции C30 (max = 495 нм) и комплексов Al(PhBTA)n (max = 440 нм) или Sc(PhBTA)n (max = 460 нм) приводят к тому, что при концентрациях С30  50 нМ в растворах НЧ наблюдается сум-
марный спектр потушенной флуоресценции
комплексов и кофлуоресценции красителя,
который трудно разделить на компоненты
(рис. 2а). При концентрации С30 от 200 нМ

Ifl + Icofl, отн. ед.

1 (а)

1

2 0,5 3 5
4 6

7
0 350 400 450 500 550 600 650

1 (б)

4

Ifl + Icofl, отн. ед.

0,5
3
2 1
3050 400 450 500 550 600 650
Длина волны , нм
Рис. 2. Зависимость суммарного спектра флуоресценции комплексов и кофлуоресценции кумарина 30 (С30) в НЧ, формирующихся в водно-спиртовых (10% С3Н7ОН) растворах 10 мкМ М(III) + 3,75 мкМ PhBTA + 1,25 мкМ phen, от концентрации C30 в растворе. а – М(III) = Al(III), при [C30]: 1 – 0, 2 – 50, 3 – 200, 4 – 300, 5 – 500, 6 – 1000, 7 – 10 000 нМ; б – М(III) = La(III), при [C30]: 1 – 0 (Ifl увеличено в 5 раз), 2 – 5 (Ifl + Icofl увеличено в 5 раз), 3 – 50, 4 – 1000 нМ.

“Оптический журнал”, 80, 3, 2013

5

вклад спектра флуоресценции комплексов в суммарный спектр флуоресценции НЧ из комплексов Sc или Al незначителен. Учет вклада потушенной флуоресценции комплексов Al и Sc в области спектра кофлуоресценции С30 проводился путем линейной интерполяции данных о тушении флуоресценции комплексов Al и Sc при больших концентрациях С30 в область его концентраций 50 нМ. Интенсивность спектров флуоресценции комплексов ионов тяжелых металлов Y, La, Gd, Lu была на порядок ниже, что позволяло надежно исследовать кофлуоресценцию C30 в широкой области его концентраций в растворе (рис. 2б). Спектры поглощения измерялись на спектрофотометре Cary 500, спектры флуоресценции и спектры возбуждения флуоресценции – на спектрофлуориметре Hitachi 650-40.
Результаты и обсуждение
Влияние центрального иона комплексов на Icofl красителя C30, внедренного в НЧ
как примесь
В результате работы были измерены и сопоставлены спектры кофлуоресценции красителя С30 и спектры флуоресценции комплексов в растворах НЧ из дикетонатов с ионами легких (Аl, Sc) и тяжелых (Y, La, Gd, Lu) металлов, на порядки различающихся величинами fl. При возбуждении в полосу поглощения комплексов (ехс = 365 нм) в присутствии С30  50 нМ в растворе наблюдается усиление

интенсивности флуоресценции С30 в 20–25
раз по сравнению с интенсивностью свободно-
го красителя в растворе при его возбуждении
в максимум собственной полосы поглощения (ехс = 427 нм). Это свидетельствует о внедрении С30 в НЧ.
В табл. 1 приведены значения If0l самого дикетона PhBTA и его комплексов с ионами
в отсутствие С30 и Icofl C30 в НЧ из комплексов шести ионов с PhBTA в присутствии 50 нМ
С30 в растворе. Из табл. 1 видно, что так же,
как ранее для НЧ из комплексов DBM c ионами
металлов, допированных R6G и NR [10], в НЧ
из комплексов PhBTA, допированных С30, при
его концентрации в растворе 50 нМ величина
Icofl мало меняется под влиянием координации лигандов с более тяжелым ионом металла.
При Ifl комплексов Y(III), в 30 раз меньшей Ifl комплексов Al(III), величины Icofl C30 в НЧ из этих разных комплексов отличаются не-
значительно. Эти данные подтверждают вы-
вод, что в условиях низких концентраций
(не более 50 нМ) С30 в растворе величина Icofl при его внедрении в НЧ из комплексов ионов
с PhBTA почти не зависит от выбора централь-
ного иона комплекса, а следовательно, мало зависит от fl комплексов. Можно предполагать, что основным фактором, определяющим
величину Icofl красителя, является длина пробега синглетного экситона в НЧ, размер кото-
рой соизмерим с размером самих НЧ. Однако
следует заметить, что при этом величины Icofl могут отличаться в НЧ из комплексов разных
ионов из-за ряда факторов: различия в раз-

Таблица 1. Зависимости собственной интенсивности (If0l) флуоресценции комплексов и кофлуоресценции (Icofl) красителя C30 и maxсоfl от выбора центрального иона комплексов при двух концентрациях С30, внедренного в НЧ из комплексов, формирующиеся в растворе 10 мкМ М(III) +3,75 мкМ
PhBTA + 1,25 мкМ phen в Н2О + 10 об.% С3Н7 ОН при Т = 293 K. Значения If0l приведены в отн. ед. для одинакового поглощения комплексов при exc = 365 нм

Ион, M(III)

M(PhBTA)3phen I0fl mflax

M(PhBTA)3phen + 50 нМ С30

Icofl

mсоafxl

M(PhBTA)3phen + 1000 нМ С30 Icofl Ifl mсоafxl

Нет 12 460

0

0—

Al 850 445 210 — 300 27 510

Sc 300 460 250 — 630 2,0 510

Y 30 435 360

508

3200