Флуоресцентный анализ паттернов метаболической активности нейрон-глиальной сети
ИКОНИКА – НАУКА ОБ ИЗОБРАЖЕНИИ
УДК 53.086 + 577.3
ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ ПАТТЕРНОВ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙРОН-ГЛИАЛЬНОЙ СЕТИ
© 2012 г. Ю. Н. Захаров*, канд. физ.-мат. наук; Е. В. Митрошина**, аспирантка; М. В. Ведунова**, канд. биол. наук; С. А. Коротченко*, аспирантка; Я. И. Калинцева*, аспирантка; А. В. Потанина*, аспирантка; И. В. Мухина**, доктор биол. наук ** Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, г. Нижний Новгород ** Нижегородская государственная медицинская академия, г. Нижний Новгород ** Е-mail: zhrv@rf.unn.ru
Показано наличие спонтанной сетевой активности в нейрон-глиальной сети в виде паттернов, имеющих одинаковый характер осцилляций, и синхронное переключение режимов генерации всех паттернов путем регистрации флуоресценции специфических индикаторов для визуализации динамики кальциевых осцилляций в клеточных культурах и переживающих срезах гиппокампа мозга.
Ключевые слова: оптика для медицины и биотехнологии, система визуализации, конфокальная микроскопия, нейрофизиология, нейрон, глия.
Коды OCIS: 170.0170, 170.0110, 170.1790, 170.2520, 170.5810, 170.5380, 170.1530.
Поступила в редакцию 07.04.2011.
Для исследования принципов структурнофункциональной организации клеточных сетей мозга и выявления взаимосвязей между механизмами, ответственными за когнитивные функции нервной системы, необходим многофакторный анализ различных показателей обмена в нервной ткани. Определение особенностей динамики метаболических процессов различных веществ в тканях мозга позволяет провести тонкий анализ активности как нейронов, так и глии. В формирующихся нейронных сетях эти процессы приводят к развитию межнейронных связей и генерации спонтанной сетевой электрической активности, которую можно зарегистрировать с помощью микроэлектродов, вводимых в клетки, или внеклеточным отведением потенциалов, используя мультиэлектродные матрицы [1].
Оптический имиджинг* является наиболее информативным методом при измерениях пространственного распределения характеристик объекта исследования. Информацию об изменении концентрации конкретных ком-
* Под этим термином понимается процесс сбора информации об объекте путем наблюдения и регистрации оптических изображений.
понентов биологических тканей может дать характер флуоресценции либо самих исследуемых элементов, если они обладают собственной флуоресценцией, либо связанных с ними специфических красителей. Динамика внутриклеточной концентрации ионов кальция (кальциевые осцилляции), определяемая по изменению интенсивности или спектра флуоресценции введенных в тела или отростки клеток кальциевых индикаторов, служит надежным показателем функциональной активности не только нейронных, но и глиальных сетей.
Материалы и методы
Предметом изучения являлись нейрон-глиальные сети, образованные в культурах клеток и в переживающих срезах гиппокампа мозга мышей или крыс.
Диссоциированные культуры клеток выделяли из мозга 18-дневных (Е18) эмбрионов мышей С57BL/6 и культивировали на мультиэлектродной матрице системы MED64 [1].
Для исследования спонтанной кальциевой активности нейронов и глии в переживающих
“Оптический журнал”, 79, 6, 2012
47
срезах гиппокампа крыс использовались поперечные срезы гиппокампа толщиной 350 мкм, которые получали из мозга самцов крыс линии Вистар возрастом 10–14 дней (Р10–P14). После приготовления срезы перфузировались в постоянно карбогенизируемом растворе Рингера при температуре 36 С [2].
Для исследований спонтанных кальциевых осцилляций, отражающих функциональное состояние кальциевого гомеостаза клеток, формирующих in vitro либо in vivo нейрон-глиальную сеть, использовался лазерный сканирующий микроскоп Zeiss LSM 510 NLO Duoscan. В качестве флуоресцентных зондов были выбраны специфический кальциевый краситель Oregon Green 488 BAPTA-1 АМ (OGB1) [3] с константой диссоциации Kd = 170 нМ, возбуждаемый линией излучения аргонового лазера = 488 нм и Са2+-нечувствительный краситель Sulforhodamine 101 (SR101), возбуждаемый излучением гелий-неонового лазера = 543 нм, селективно маркирующий глиальные клетки [4]. Эти длины волн близки к максимумам спектров поглощения соответствующих красителей. Излучение флуоресценции разделялось по каналам регистрации с помощью дихроичных зеркал и светофильтров с полосой пропускания 650–710 нм для выделения флуоресценции SR101 и 500–530 нм – для выделения флуоресценции OGB1.
Регистрировались временные серии изображений поля флуоресценции красителей SR101 как глиального маркера и OGB1 как индикатора свободного кальция. Первичная обработка полученных изображений заключалась в сравнении и наложении изображений разных каналов регистрации для идентификации нейрональных и глиальных клеток и записи функции F(t) средней интенсивности флуоресценции OGB1 выделенной области поля (совпадающей, как правило, с телом или частью отростка клетки) от времени. Интенсивность флуоресценции показывала зависимость внутриклеточной концентрации ионов кальция от времени, свидетельствующую о метаболической активности клеток, связанных в сети определенной архитектуры. Выделение кальциевых осцилляций, полученных при помощи флуоресцентной конфокальной микроскопии, проводили с помощью оригинального программного пакета “Astroscanner” [5]. Анализировались временные характеристики функции F(t). Для определения времени начала (tstart) и конца (tend) осцилляции был взят по-
рог производной сигнала по времени в размере средней квадратичной ошибки распределения F/t. Отмечались также моменты времени достижения максимальной интенсивности флуоресценции (tmax) для каждой осцилляции. Учитывались следующие параметры: длительность достижения максимума (длительность переднего фронта осцилляции), общая длительность осцилляции и интервалы между максимумами.
В связи с тем, что индикаторы с высокой афинностью, к которым относится OGB1, могут значительно исказить кинетику быстрых изменений концентрации свободных ионов кальция ([Ca2+]i) [6], при интерпретации F(t) необходимо учитывать конечность скорости ассоциации и диссоциации ионов кальция с молекулами красителя.
Временное разрешение регистрации изменений [Ca2+]i зависит как от скорости сканирования, так и от афинности индикатора –
t = tдискр + ,
где tдискр – согласно теореме Котельникова определяется частотой дискретизации отсчетов (tдискр = 2/fдискр), в нашем случае fдискр – это частота кадров; – постоянная времени, характеризующая скорость переходных процессов, которая определяется постоянной времени ассоциации красителя (a) со свободными ионами кальция (OGВ1 + Ca2+) или постоянной времени диссоциации (d) красителя со свободными ионами кальция (Ca2+ – OGВ1).
При определении параметров кинетики кальциевых осцилляций учитывали следующие условия:
1) для переднего фронта осцилляции t = = tдискр (
УДК 53.086 + 577.3
ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ ПАТТЕРНОВ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙРОН-ГЛИАЛЬНОЙ СЕТИ
© 2012 г. Ю. Н. Захаров*, канд. физ.-мат. наук; Е. В. Митрошина**, аспирантка; М. В. Ведунова**, канд. биол. наук; С. А. Коротченко*, аспирантка; Я. И. Калинцева*, аспирантка; А. В. Потанина*, аспирантка; И. В. Мухина**, доктор биол. наук ** Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, г. Нижний Новгород ** Нижегородская государственная медицинская академия, г. Нижний Новгород ** Е-mail: zhrv@rf.unn.ru
Показано наличие спонтанной сетевой активности в нейрон-глиальной сети в виде паттернов, имеющих одинаковый характер осцилляций, и синхронное переключение режимов генерации всех паттернов путем регистрации флуоресценции специфических индикаторов для визуализации динамики кальциевых осцилляций в клеточных культурах и переживающих срезах гиппокампа мозга.
Ключевые слова: оптика для медицины и биотехнологии, система визуализации, конфокальная микроскопия, нейрофизиология, нейрон, глия.
Коды OCIS: 170.0170, 170.0110, 170.1790, 170.2520, 170.5810, 170.5380, 170.1530.
Поступила в редакцию 07.04.2011.
Для исследования принципов структурнофункциональной организации клеточных сетей мозга и выявления взаимосвязей между механизмами, ответственными за когнитивные функции нервной системы, необходим многофакторный анализ различных показателей обмена в нервной ткани. Определение особенностей динамики метаболических процессов различных веществ в тканях мозга позволяет провести тонкий анализ активности как нейронов, так и глии. В формирующихся нейронных сетях эти процессы приводят к развитию межнейронных связей и генерации спонтанной сетевой электрической активности, которую можно зарегистрировать с помощью микроэлектродов, вводимых в клетки, или внеклеточным отведением потенциалов, используя мультиэлектродные матрицы [1].
Оптический имиджинг* является наиболее информативным методом при измерениях пространственного распределения характеристик объекта исследования. Информацию об изменении концентрации конкретных ком-
* Под этим термином понимается процесс сбора информации об объекте путем наблюдения и регистрации оптических изображений.
понентов биологических тканей может дать характер флуоресценции либо самих исследуемых элементов, если они обладают собственной флуоресценцией, либо связанных с ними специфических красителей. Динамика внутриклеточной концентрации ионов кальция (кальциевые осцилляции), определяемая по изменению интенсивности или спектра флуоресценции введенных в тела или отростки клеток кальциевых индикаторов, служит надежным показателем функциональной активности не только нейронных, но и глиальных сетей.
Материалы и методы
Предметом изучения являлись нейрон-глиальные сети, образованные в культурах клеток и в переживающих срезах гиппокампа мозга мышей или крыс.
Диссоциированные культуры клеток выделяли из мозга 18-дневных (Е18) эмбрионов мышей С57BL/6 и культивировали на мультиэлектродной матрице системы MED64 [1].
Для исследования спонтанной кальциевой активности нейронов и глии в переживающих
“Оптический журнал”, 79, 6, 2012
47
срезах гиппокампа крыс использовались поперечные срезы гиппокампа толщиной 350 мкм, которые получали из мозга самцов крыс линии Вистар возрастом 10–14 дней (Р10–P14). После приготовления срезы перфузировались в постоянно карбогенизируемом растворе Рингера при температуре 36 С [2].
Для исследований спонтанных кальциевых осцилляций, отражающих функциональное состояние кальциевого гомеостаза клеток, формирующих in vitro либо in vivo нейрон-глиальную сеть, использовался лазерный сканирующий микроскоп Zeiss LSM 510 NLO Duoscan. В качестве флуоресцентных зондов были выбраны специфический кальциевый краситель Oregon Green 488 BAPTA-1 АМ (OGB1) [3] с константой диссоциации Kd = 170 нМ, возбуждаемый линией излучения аргонового лазера = 488 нм и Са2+-нечувствительный краситель Sulforhodamine 101 (SR101), возбуждаемый излучением гелий-неонового лазера = 543 нм, селективно маркирующий глиальные клетки [4]. Эти длины волн близки к максимумам спектров поглощения соответствующих красителей. Излучение флуоресценции разделялось по каналам регистрации с помощью дихроичных зеркал и светофильтров с полосой пропускания 650–710 нм для выделения флуоресценции SR101 и 500–530 нм – для выделения флуоресценции OGB1.
Регистрировались временные серии изображений поля флуоресценции красителей SR101 как глиального маркера и OGB1 как индикатора свободного кальция. Первичная обработка полученных изображений заключалась в сравнении и наложении изображений разных каналов регистрации для идентификации нейрональных и глиальных клеток и записи функции F(t) средней интенсивности флуоресценции OGB1 выделенной области поля (совпадающей, как правило, с телом или частью отростка клетки) от времени. Интенсивность флуоресценции показывала зависимость внутриклеточной концентрации ионов кальция от времени, свидетельствующую о метаболической активности клеток, связанных в сети определенной архитектуры. Выделение кальциевых осцилляций, полученных при помощи флуоресцентной конфокальной микроскопии, проводили с помощью оригинального программного пакета “Astroscanner” [5]. Анализировались временные характеристики функции F(t). Для определения времени начала (tstart) и конца (tend) осцилляции был взят по-
рог производной сигнала по времени в размере средней квадратичной ошибки распределения F/t. Отмечались также моменты времени достижения максимальной интенсивности флуоресценции (tmax) для каждой осцилляции. Учитывались следующие параметры: длительность достижения максимума (длительность переднего фронта осцилляции), общая длительность осцилляции и интервалы между максимумами.
В связи с тем, что индикаторы с высокой афинностью, к которым относится OGB1, могут значительно исказить кинетику быстрых изменений концентрации свободных ионов кальция ([Ca2+]i) [6], при интерпретации F(t) необходимо учитывать конечность скорости ассоциации и диссоциации ионов кальция с молекулами красителя.
Временное разрешение регистрации изменений [Ca2+]i зависит как от скорости сканирования, так и от афинности индикатора –
t = tдискр + ,
где tдискр – согласно теореме Котельникова определяется частотой дискретизации отсчетов (tдискр = 2/fдискр), в нашем случае fдискр – это частота кадров; – постоянная времени, характеризующая скорость переходных процессов, которая определяется постоянной времени ассоциации красителя (a) со свободными ионами кальция (OGВ1 + Ca2+) или постоянной времени диссоциации (d) красителя со свободными ионами кальция (Ca2+ – OGВ1).
При определении параметров кинетики кальциевых осцилляций учитывали следующие условия:
1) для переднего фронта осцилляции t = = tдискр (